最终出图如下
这里自动做统计检验的函数是 stat_compare_means()
读入数据
作图
这个函数来自于ggpubr这个包，只需要指定根据那一列来分组就可以了
默认的是Wilcoxon Rank Sum and Signed Rank Tests，如果要用t检验指定method参数
如果想把P值改成星号，直接加label=“p.signif”参数
这里如果不显著会在图上显示ns，如果不想要ns，可以加 hide.ns = TRUE 参数
星号的位置可以手动指定，用 label.y = c(26,31) 参数
使用到的是 ggsignif 这个包
小明的数据分析笔记本
转录组分析中，计算了两组间差异表达的基因后，通常怎样表示？您可能第一时间想到可以使用火山图。的确，火山图是使用频率最多的，在火山图中可以很轻松地根据基因在两组间的Fold Change值以及显著性p值，识别和判断差异表达基因概况。火山图实质上就是一种散点图，通常横纵坐标分别代表了log2转化后的Fold Change以及-log10转化后的p值或p调整值信息（下图左）。提到散点图，常见的还有另一种展示差异表达基因的样式：横纵坐标轴可分别代表两组基因表达均值，这种风格可以更方便直观对比基因在两组中的差异状态。
本篇教程就让我们来学习如何绘制右图这种“对称散点图”，展示组间差异基因表达格局。
示例文件“gene_diff.txt”是一组基因差异表达分析结果，记录了处理组（treat）和对照组（control）间表达显著不一致的基因，鉴定标准为p<0.01以及|log2 Fold Change|≥1。
其中，gene_id为基因名称；control和treat代表了两组中基因的平均表达值；log2FoldChange即log2转化后的基因表达差异倍数；pvalue是差异基因显著性p值；diff为根据p<0.01以及|log2 Fold Change|≥1筛选的差异基因，该列中“up”为上调，“down”为下调，“none”为非差异基因。
接下来通过该示例文件，展示使用R语言绘制差异基因表达“对称散点图”过程。
首先对数据做一些预处理。
例如，基因表达值数量级相差过大，取个对数转换；基因名称按是否为差异基因作个排序，避免后续作图时被不显著的基因点遮盖，即排序的目的是让这些显著基因的点都位于图的上方。
下来就可以使用预处理后的数据作图了。
第一种类型是将基因按上调、下调或不显著类型着色，便于从图中辨认差异基因。我们使用ggplot2的方法绘制差异基因散点图。
两个坐标轴分别代表了处理组（treat）和对照组（control），图中的点代表各基因在两组中的平均表达值（已经作了log转换）。treat组和control组相比，上调基因以红色表示，下调基因以绿色表示。图中的虚线代表了|log2FC|=1时的阈值线。
在该图中，我们可以很轻松地观察差异基因整体分布状态和数量比较的信息。
上图中没有将p值信息展示出。因此另一种思路是，颜色代表p值，这样就可以在图中获得一个渐变梯度。同样使用ggplot2的方法绘制，和上述过程相比仅在颜色指定上存在区别。
类似上图，两个坐标轴分别代表了处理组（treat）和对照组（control），图中的点代表各基因在两组中的平均表达值（已经作了log转换），图中的虚线代表了|log2FC|=1时的阈值线。
和上图不同点在于，此时基因按显著性p值着色，从不显著>显著展示以蓝色>红色渐变，就获得了一种梯度信息。这样可以很方便地看出，在两组中的表达值差异越大的基因，p值越小，二者趋势是一致的，重在描述了差异倍数和p值的关系。
今天就先来聊聊如何看差异表达基因数据，火山图，聚类图又怎么看。1差异基因筛选方法那差异基因是如何筛选出来的呢？差异基因的筛选方法有很多，包括倍数法、T检验、F检验及SAM等。下面简单介绍一下GCBI上用的倍数法和SAM法。
倍数法适用于没有生物学重复的样本，其计算基因在两个条件下表达水平的比值，确定比值的阈值，将绝对值大于此阈值的基因判断为差异基因。
SAM算法适用于有生物学重复的样本，通过对分母增加一个常量 T 检验过程减小了假阳性发生的概率。文献中报道，相较于其他算法，SAM算法更为稳定，筛选出的结果也更为准确。2差异基因数据解读经过合适的差异基因方法筛选出的差异基因，结果一般分为两部分，数据+图形。
数据结果展示如下图所示（两分组）众多参数中，重点看三个。p-value或q-value没有做生物学重复请跳过这一步。
p-value或q-value是统计学检验变量，代表差异显著性，一般p-value或q-value小于0.05代表具有显著性差异，但可根据具体情况适当调整。
因为p-value或q-value衡量地是某个基因假阳性的概率，如果p-value或q-value越低，那么挑选该基因出现假阳性的概率就越低，可验证性就越高。
两者具体的计算方法具体如下：那p-value、q-value同时存在时看哪个呢？
SAM法只有q-value。当两者同时存在时，可根据具体情况具体分析。
差异筛选是一个典型的多重假设检验过程，对于多重假设检验，单次检验中差异显著基因的假阳性率(p-value较小)可能会较大，而q-value和FDR值较常见的BH校正方法得到的FDR值而言，改进了其对假阳性估计的保守性。
即q-value相比于p-value更加严格，当差异基因结果较少时，可以退而求其次看p-value。Fold ChangeFold Change表示实验组比上对照组的差异表达倍数，一般表达相差2倍以上是有意义的，放宽要求1.5倍或者1.2倍也可以接受。
看表达倍数的同时还需结合基因表达丰度，信号值太低的基因会在后续的验证实验中检测不到。3差异基因图表解读在差异结果的图形展示结果中，主要是火山图和聚类图。火山图火山图只针对两分组且有生物学重复的情况。
如何看火山图呢？火山图可反映总体基因的表达情况，横坐标代表log2（Fold Change）,纵坐标表示-log10（P值），每个点代表一个基因，颜色用以区分基因是否差异表达，图中橙色的点代表差异表达基因，蓝色的点代表没有差异表达的基因。聚类图聚类图可以衡量样本或基因之间表达的相似性。
如上图所示的聚类图中，横坐标代表样本聚类，一列代表一个样本，聚类基于样本间基因表达的相似性，样本间基因表达越接近，靠的越近，以此类推。
纵坐标代表基因聚类，一行代表一个基因，聚类基于基因在样本中表达的相似性，基因在样本中表达越接近，靠的越近，以此类推。
色阶代表基因表达丰度，越红代表上调得越明显，越绿代表下调得越明显。
如何做聚类图请戳往期推送做个聚类图只需1分钟
差异基因有了，如何挑选潜在基因进行实验验证呢？
关键还在于感兴趣点在哪了。粗略的看，可以先看KEGG或者GO功能分类，看差异基因具体富集在哪些通路或功能。
比如关注的是细胞内酸合成关键酶，可以重点看酸合成和碳流相关通路。具体如何看KEGG或者GO功能分类，请听下回分解。
