常规热图示例
我们先来看看下面这张图，这是一篇发表在 PLoS Medicine (IF = 11.048) 上的文章图，来看 22 种免疫细胞群体之间的相关性，其中红色的颜色代表正相关，蓝色代表负相关。每一格的数字代表相关系数。这是一种经常会用到的图形，不同于常规热图。常规热图中的每行代表一个观察值，每列代表一个样本，而我们在本次教程中，将为大家带来更高级，也更美观的相关性热图。
相关性热图
Step 1： R 包安装和数据输入
首先是安装必须 R 包，在这里我们需要用到 ggcorplot 和 ggthemes 这两个R包。
然后我们读入R表达谱数据。
数据一共有 10 个样本和 20 个基因，每一行为一个基因，每一列为一个样本，我们需要看这 20 个基因在这 10 个样本中的共表达情况，也就是基因和基因之间的相关性。
Step 2： 相关性计算
为了表示基因与基因相关性，我们除了要计算它们的相关性系数，还需要计算体现其显著性的 P 值。
计算相关性系数并显示前 6 个基因之间的相关性。相关性系数大于 0 为正相关，小于 0 为负相关。
计算基因与基因之间的相关性 P 值，其中 P 小于 0.05 认为这两个基因之间相关性是显著的。
Step 3： 相关性热图绘制
使用 ggcorplot 绘制基因与基因之间相关性热图。
Step 4： 初级美化 Circle
美化第一步，我们将矩形热图改成圆形
是不是大家瞬间觉得眼前一亮？
Step 5： 中级美化 Clustering
虽然有所美观，但是，这样上面一张相关性热图还是存在问题的，大家是否发现热图中的点非常乱，让人没办法捕捉到其中的规律，不容易让人一眼抓住重点。所以，我们要对基因进行聚类。
这张热图，已经是非常漂亮了，放在文章中绝对让人眼睛一亮，正相关负相关基因清清楚楚。
Step 6： 高级美化 Triangle
当然，我们还可以进一步改善。因为相关性之间其实是有对称在的，左上角和右下角的图其实是一样的，这样绘制比较占版面。只绘制左上角的热图，可以让我们的图看起来没有那么臃肿。
Step 7： 终级美化 Label
那么如何显示相关性强弱呢，虽然颜色和点的大小可以看出来，但是毕竟没有那么直观。所以我们将相关性系数加上，并更改热图颜色。
这样基因相关性热图就相当完美了，可以直接放在文章图中，而且比 PLoS Medicine 那篇文章看起来更漂亮呢。
Step 8： 究级美化 Omit
不过，如果我们想知道哪些基因显著性是小于 0.05 的呢，虽然颜色和点的大小以及相关性系数可以看出来，但是如果被老板们问起，模棱两可的回答，可是相当危险的哦。所以，我们把显著性p值加上，并且直接隐藏 P 小于 0.05 的基因。
GSE112996_merged_fpkm_table.txtGSE112996_series_matrix.txt，把GSE112996_series_matrix.txt解压，得到如下两个文件，把这两个文件放到对应的project文件夹内（备注：GSE112996_merged_fpkm_table是这个数据集的补充表达矩阵，不是所有数据集都有这个格式的）
可以看到读取的表达矩阵，第一列是基因名
去掉基因名，得到纯粹的表达矩阵raw_data
得到每种免疫细胞对应的基因
画相关图，原理和上面差不多
最近在一篇文献中看到了肿瘤纯度，当作背景知识补充一下。
ESTIMATE算法，可以根据表达数据估计肿瘤样本的基质分数(stromal score )和免疫分数(immune score)，用于代表基质和免疫细胞的存在。两个分数相加即得到estimate score，可用于估计肿瘤纯度。
该算法于2013年发表在NC上: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3826632/
2015年又有一篇NC: https://www.nature.com/articles/ncomms9971#MOESM1235 。 用4种方法计算了TCGA样本的肿瘤纯度，其中就有ESTIMATE。
但作者的提供的帮助文档里只有芯片数据计算方式，而未提到转录组数据如何处理。我探索了一下发现，是可以计算的，作者在estimate网站上也提供了部分TCGA project的计算结果。
一番搜索找到曾老板写的帖子，可谓一站式找齐了：
关于算法： https://mp.weixin.qq.com/s/LiL_TZiJztUClz86a-aHWQ ，介绍了算法的基本原理和方法。
关于R包的用法： https://mp.weixin.qq.com/s/JTD8ZmH2YYCIqcbs-97JzA ，介绍了芯片数据如何得到三个score和肿瘤纯度
转录组数据计算： https://mp.weixin.qq.com/s/UehaaJZgARryH7P25v9wNQ ，介绍了转录组数据如何得到三个score和肿瘤纯度
找了TCGA的ACC count数据作为示例数据。如果你想要我的示例数据，请在生信星球公众号后台回复“est766”。用自己的count数据也可以噢。
这是曾老板写的函数，转录组数据与芯片数据计算过程不同的地方是 platform 是illumina。
affy芯片输出结果是有这一列的。
我对比了一下15年的那篇NC的方法部分，他们计算使用的是 level 3 RNA-seq profiles (RNAseqV2 normalized RSEM)数据，用estimate包计算了scores，用13年NC文章中的公式计算了肿瘤纯度。
公式是：
Tumour purity=cos (0.6049872018+0.0001467884 × ESTIMATE score)
不要忘了R语言是个好计算器
15年的文章给出了计算结果，我复现一下他的计算。RNAseqV2 normalized RSEM 数据不好找，我是从firehouse浏览器找到的，并进行了一些整理，让它变成了规范的表达矩阵。
我把这个计算结果与15年的NC做了比较，一毛不差，开心。
我把两个数据处理得到的结果组成一个表格来比较一下：
相差无几咯。非常完美的结果。
illumina输出结果不带有Tumorpurity列，这是包自身的设置。
在biostars上面看到一个讨论，有人认为estimate score 计算肿瘤纯度的公式是根据Affymetrix的芯片数据得出的，是专门针对芯片数据使用，因此不可以用于转录组。建议只计算出estimate score，用这个分数来代替肿瘤纯度的绝对数值用于后续分析。
原帖讨论见： https://www.biostars.org/p/279853/
然而NC 15年就已经发了这篇文章，五年来没人反对，可以认为人家做的是可用的，用就是了呗。
