cellranger count 计算的结果只能作为错略观测的结果，如果需要进一步分析聚类细胞，还需要进行下游分析，这里使用官方推荐 R 包（Seurat 3.0）
流程参考官方外周血分析标准流程（ https://satijalab.org/seurat/v3.0/pbmc3k_tutorial.html ）
Rstudio操作过程：
## 安装seurat
install.packages('Seurat')
## 载入seurat包
library(dplyr)
library(Seurat)
## 读入pbmc数据（文件夹路径不能包含中文，注意“/“的方向不能错误，这里读取的是10x处理的文件，也可以处理其它矩阵文件，具体怎样操作现在还不知道，文件夹中的3个文件分别是：barcodes.tsv，genes.tsv，matrix.mtx，文件的名字不能错，否则读取不到）
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "D:/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
## 查看稀疏矩阵的维度,即基因数和细胞数
dim(pbmc.data)
pbmc.data[1:10,1:6]
## 创建Seurat对象与数据过滤，除去一些质量差的细胞（这里读取的是单细胞 count 结果中的矩阵目录；在对象生成的过程中，做了初步的过滤；留下所有在>=3 个细胞中表达的基因 min.cells = 3；留下所有检测到>=200 个基因的细胞 min.genes = 200。)
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc
##计算每个细胞的线粒体基因转录本数的百分比（%）,使用[[ ]] 操作符存放到metadata中，mit-开头的为线粒体基因
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
##展示基因及线粒体百分比（这里将其进行标记并统计其分布频率，"nFeature_RNA"为基因数，"nCount_RNA"为细胞数，"percent.mt"为线粒体占比）
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
## 过滤细胞：根据上面小提琴图中基因数"nFeature_RNA"和线粒体数"percent.mt"，分别设置过滤参数，这里基因数 200-2500，线粒体百分比为小于 5%，保留gene数大于200小于2500的细胞；目的是去掉空GEMs和1个GEMs包含2个以上细胞的数据；而保留线粒体基因的转录本数低于5%的细胞,为了过滤掉死细胞等低质量的细胞数据。
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA >200 &nFeature_RNA <2500 &percent.mt <5)
## 表达量数据标准化,LogNormalize的算法：A = log( 1 + ( UMIA ÷ UMITotal ) × 10000
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
#pbmc <- NormalizeData(pbmc) 或者用默认的
## 鉴定表达高变基因(2000个）,用于下游分析,如PCA；
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
## 提取表达量变化最高的10个基因；
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
top10
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10)
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
plot1<-VariableFeaturePlot(object=pbmc)
plot2<-LabelPoints(plot=plot1,points=top10,repel=TRUE)
CombinePlots(plots=list(plot1,plot2))
## PCA分析：
# PCA分析数据准备,使用ScaleData()进行数据归一化；默认只是标准化高变基因（2000个）,速度更快,不影响PCA和分群,但影响热图的绘制。
#pbmc <- ScaleData(pbmc,vars.to.regress ="percent.mt")
## 而对所有基因进行标准化的方法如下：
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)
pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")
## 线性降维（PCA）,默认用高变基因集,但也可通过features参数自己指定；
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
## 展示 pca 结果（最简单的方法）
DimPlot(object=pbmc,reduction="pca")
## 检查PCA分群结果, 这里只展示前5个PC,每个PC只显示5个基因；
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)
##PC_ 1
##Positive: RPS27, MALAT1, RPS6, RPS12, RPL13
##Negative: CSTA, FCN1, CST3, LYZ, LGALS2
##PC_ 2
##Positive: NKG7, GZMA, CST7, KLRD1, CCL5
##Negative: RPL34, RPL32, RPL13, RPL39, LTB
##PC_ 3
##Positive: MS4A1, CD79A, BANK1, IGHD, CD79B
##Negative: IL7R, RPL34, S100A12, VCAN, AIF1
##PC_ 4
##Positive: RPS18, RPL39, RPS27, MALAT1, RPS8
##Negative: PPBP, PF4, GNG11, SDPR, TUBB1
##PC_ 5
##Positive: PLD4, FCER1A, LILRA4, SERPINF1, LRRC26
##Negative: MS4A1, CD79A, LINC00926, IGHD, FCER2
## 展示主成分基因分值
VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")
## 绘制pca散点图
DimPlot(pbmc, reduction = "pca")
## 画第1个或15个主成分的热图；
DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)
DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)
## 确定数据集的分群个数
# 鉴定数据集的可用维度，方法1：Jackstraw置换检验算法；重复取样（原数据的1%）,重跑PCA,鉴定p-value较小的PC；计算‘null distribution’(即零假设成立时)时的基因scores。虚线以上的为可用维度，也可以调整 dims 参数，画出所有 pca 查看。
#pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
#pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
#JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)
# 方法2：肘部图（碎石图）,基于每个主成分对方差解释率的排名。
ElbowPlot(pbmc)
## 细胞聚类：分群个数这里选择10,建议尝试选择多个主成分个数做下游分析,对整体影响不大；在选择此参数时,建议选择偏高的数字（为了获取更多的稀有分群,“宁滥勿缺”）；有些亚群很罕见,如果没有先验知识,很难将这种大小的数据集与背景噪声区分开来。
## 非线性降维（UMAP/tSNE)基于PCA空间中的欧氏距离计算nearest neighbor graph,优化任意两个细胞间的距离权重（输入上一步得到的PC维数） 。
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
## 接着优化模型,resolution参数决定下游聚类分析得到的分群数,对于3K左右的细胞,设为0.4-1.2 能得到较好的结果(官方说明)；如果数据量增大,该参数也应该适当增大。
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
## 使用Idents（）函数可查看不同细胞的分群；
head(Idents(pbmc), 5)
## 结果：AAACCTGAGGTGCTAG AAACCTGCAGGTCCAC AAACCTGCATGGAATA AAACCTGCATGGTAGG AAACCTGCATTGGCGC
1 3 0 10 2
Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
## Seurat提供了几种非线性降维的方法进行数据可视化（在低维空间把相似的细胞聚在一起）,比如UMAP和t-SNE,运行UMAP需要先安装'umap-learn'包，这里不做介绍，两种方法都可以使用，但不要混用，如果混用，后面的结算结果会将先前的聚类覆盖掉，只能保留一个。
## 这里采用基于TSNE的聚类方法。
pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10)
## 用DimPlot()函数绘制散点图,reduction = "tsne",指定绘制类型；如果不指定,默认先从搜索 umap,然后 tsne, 再然后 pca；也可以直接使用这3个函数PCAPlot()、TSNEPlot()、UMAPPlot()； cols,pt.size分别调整分组颜色和点的大小；
DimPlot(pbmc,reduction = "tsne",label = TRUE,pt.size = 1.5)
## 这里采用基于图论的聚类方法
pbmc<-RunUMAP(object=pbmc,dims=1:10)
DimPlot(object=pbmc,reduction="umap")
## 细胞周期归类
pbmc<- CellCycleScoring(object = pbmc, g2m.features = cc.genes$g2m.genes, s.features = cc.genes$s.genes)
head(x = [email protected])
DimPlot(pbmc,reduction = "tsne",label = TRUE,group.by="Phase",pt.size = 1.5)
## 存储结果
saveRDS(pbmc, file = "D:/pbmc_tutorial.rds")
save(pbmc,file="D:/res0.5.Robj")
## 寻找cluster 1的marker
cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)
head(cluster1.markers, n = 5)
## 结果: p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj
MT-CO1 0.000000e+00 -0.6977083 0.985 0.996 0.000000e+00
RPS27 2.182766e-282 0.3076454 1.000 0.999 3.480202e-278
MT-CO3 2.146399e-274 -0.4866429 0.995 0.997 3.422218e-270
DUSP1 2.080878e-247 -1.7621662 0.376 0.745 3.317752e-243
RPL34 8.647733e-244 0.3367755 1.000 0.997 1.378795e-239
##寻找每一cluster的marker
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_logFC)
# A tibble: 24 x 7
# Groups: cluster [12]
p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene
<dbl> <dbl><dbl><dbl> <dbl><fct> <chr>
1 2.29e-123 0.636 0.344 0.097 3.65e-119 0 CD8B
2 7.62e-113 0.487 0.632 0.305 1.22e-108 0 LEF1
3 2.04e- 74 0.483 0.562 0.328 3.25e- 70 1 LEF1
4 1.39e- 61 0.462 0.598 0.39 2.22e- 57 1 ITM2A
5 0. 2.69 0.972 0.483 0. 2 GNLY
6 0. 2.40 0.964 0.164 0. 2 GZMB
7 1.31e-121 0.768 0.913 0.671 2.09e-117 3 JUNB
8 2.06e- 94 0.946 0.426 0.155 3.28e- 90 3 RGS1
9 2.05e-255 1.57 0.586 0.09 3.27e-251 4 GZMK
10 2.94e-140 1.57 0.69 0.253 4.68e-136 4 KLRB1
# ... with 14 more rows
## 存储marker
write.table(pbmc.markers,file="D:/allmarker.txt")
## 各种绘图
## 绘制Marker 基因的tsne图
FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", "CD8A"),cols = c("gray", "red"))
## 绘制Marker 基因的小提琴图
VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)
## 绘制分cluster的热图
top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
剩下的便是寻找基因 marker 并对细胞类型进行注释(见下回分解)
使用R语言进行协整关系检验协整检验是为了检验非平稳序列的因果关系，协整检验是解决伪回归为问题的重要方法。首先回归伪回归例子：伪回归Spurious regression伪回归方程的拟合优度、显著性水平等指标都很好，但是其残差序列是一个非平稳序列，拟合一个伪回归:#调用相关R包library(lmtest)library(tseries)#模拟序列set.seed(123456)e1=rnorm(500)e2=rnorm(500)trd=1:500y1=0.8*trd+cumsum(e1)y2=0.6*trd+cumsum(e2)sr.reg=lm(y1~y2)#提取回归残差error=residuals(sr.reg)#作残差散点图plot(error, main="Plot of error")#对残差进行单位根检验adf.test(error)## Dickey-Fuller = -2.548, Lag order = 7, p-value = 0.3463## alternative hypothesis: stationary#伪回归结果，相关参数都显著summary(sr.reg)## Residuals:## Min 1Q Median 3Q Max## -30.654 -11.526 0.359 11.142 31.006## Coefficients:## Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)## (Intercept) -29.32697 1.36716 -21.4 <2e-16 ***## y2 1.44079 0.00752 191.6 <2e-16 ***## Residual standard error: 13.7 on 498 degrees of freedom## Multiple R-squared: 0.987, Adjusted R-squared: 0.987## F-statistic: 3.67e+04 on 1 and 498 DF, p-value: <2e-16dwtest(sr.reg)## DW = 0.0172, p-value <2.2e-16恩格尔-格兰杰检验Engle-Granger第一步：建立两变量（y1,y2）的回归方程，第二部：对该回归方程的残差(resid)进行单位根检验其中，原假设两变量不存在协整关系，备择假设是两变量存在协整关系。利用最小二乘法对回归方程进行估计，从回归方程中提取残差进行检验。set.seed(123456)e1=rnorm(100)e2=rnorm(100)y1=cumsum(e1)y2=0.6*y1+e2# (伪)回归模型lr.reg=lm(y2~y1)error=residuals(lr.reg)adf.test(error)## Dickey-Fuller = -3.988, Lag order = 4, p-value = 0.01262## alternative hypothesis: stationaryerror.lagged=error[-c(99,100)]#建立误差修正模型ECM.REGdy1=diff(y1)dy2=diff(y2)diff.dat=data.frame(embed(cbind(dy1, dy2),2))#emed表示嵌入时间序列dy1,dy2到diff.datcolnames(diff.dat)=c("dy1","dy2","dy1.1","dy2.1")ecm.reg=lm(dy2~error.lagged+dy1.1+dy2.1, data=diff.dat)summary(ecm.reg)## Residuals:## Min 1Q Median 3Q Max## -2.959 -0.544 0.137 0.711 2.307## Coefficients:## Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)## (Intercept) 0.0034 0.1036 0.03 0.97## error.lagged -0.9688 0.1585 -6.11 2.2e-08 ***## dy1.1 0.8086 0.1120 7.22 1.4e-10 ***## dy2.1 -1.0589 0.1084 -9.77 5.6e-16 ***## Residual standard error: 1.03 on 94 degrees of freedom## Multiple R-squared: 0.546, Adjusted R-squared: 0.532## F-statistic: 37.7 on 3 and 94 DF, p-value: 4.24e-16par(mfrow=c(2,2))plot(ecm.reg)Johansen-Juselius(JJ)协整检验法，该方法是一种用向量自回归(VAR)模型进行检验的方法，适用于对多重一阶单整I(1)序列进行协整检验。JJ检验有两种：特征值轨迹检验和最大特征值检验。我们可以调用urca包中的ca.jo命令完成这两种检验。其语法：ca.jo(x, type = c("eigen", "trace"), ecdet = c("none", "const", "trend"), K = 2,spec=c("longrun", "transitory"), season = NULL, dumvar = NULL)其中：x为矩阵形式数据框；type用来设置检验方法；ecdet用于设置模型形式：none表示不带截距项，const表示带常数截距项，trend表示带趋势项。K表示自回归序列的滞后阶数；spec表示向量误差修正模型反映的序列间的长期或短期关系；season表示季节效应；dumvar表示哑变量设置。set.seed(12345)e1=rnorm(250,0,0.5)e2=rnorm(250,0,0.5)e3=rnorm(250,0,0.5)#模拟没有移动平均的向量自回归序列；u1.ar1=arima.sim(model=list(ar=0.75), innov=e1, n=250)u2.ar1=arima.sim(model=list(ar=0.3), innov=e2, n=250)y3=cumsum(e3)y1=0.8*y3+u1.ar1y2=-0.3*y3+u2.ar1#合并y1,y2,y3构成进行JJ检验的数据库；y.mat=data.frame(y1, y2, y3)#调用urca包中cajo命令对向量自回归序列进行JJ协整检验vecm=ca.jo(y.mat)jo.results=summary(vecm)#cajorls命令可以得到限制协整阶数的向量误差修正模型的最小二乘法回归结果vecm.r2=cajorls(vecm, r=2)vecm.r2## Call:lm(formula = substitute(form1), data = data.mat)## Coefficients:## y1.d y2.d y3.d## ect1 -0.33129 0.06461 0.01268## ect2 0.09447 -0.70938 -0.00916## constant 0.16837 -0.02702 0.02526## y1.dl1-0.22768 0.02701 0.06816## y2.dl1 0.14445 -0.71561 0.04049## y3.dl1 0.12347 -0.29083 -0.07525## $beta## ect1 ect2## y1.l2 1.000e+00 0.0000## y2.l2 -3.402e-18 1.0000## y3.l2 -7.329e-01 0.2952
