如果要找合理解释，那么针对第一点，就是每天仍然有大量新接触生信数据分析的朋友；针对第二点，......在前两天我推的文稿《零基础快速完成基因功能注释 / GO / KEGG / PFAM...》中，评论区答应了下，阅读过5000，那就写一写富集分析。于是，如果不写，总是不对。如果要写，只能现在写。毕竟有些事情，现在不做，以后真的不会做。
对于这一块，完全陌生的朋友，尤其是不少生物学背景朋友，有必要温习一下数理统计基础。这一稿件只做原理最简单的但使用最广泛其速度最快的Over-Represence Analysis模式的富集分析讲演。其他模式，不涉及。
回到主题，先举个经典的抽球例子：
小红小绿小蓝三个人自称有超能力，可以用手摸摸球就分辨出黑球白球，于是我们找来黑袋子，放100个球，其中20个白球80个黑球，让三人分别无放回地抽取。
小红随机抽出来10个球，其中2个白球8个黑球，情况即，
抽球中白球比例与背景白球比例完全一致，说明小红抽球结果随机。
球放回去，小绿来抽球，抽出来的10个球，其中3个白球7个黑球，情况即，
这是经典的抽球案例，抽取到的白球个数的概率分布为超几何分布。基于此，我们可以简单计算抽取到比小绿抽取到球个数（或更多即更极端）的概率如何，在 R语言中计算，即
而对于小蓝的情况，那么概率如何？
在 TBtools 中也可以计算，只是写法有点区别
可以看到，尽管这只是一次抽球，小绿抽球中白球比例（或更极端情况）出现的概率是31.88%+，还是挺高的，于是我们有较高的把握说，小绿嘛，只是走了狗屎运。相反，小蓝抽球中白球比例或更极端情况出现的概率几乎为 0 ，我们几乎没啥把握说，小蓝走狗屎运....换句话说，我们有理由相信，或许小蓝真有抽白球的超能力.....
说了这么多，那么跟基因集合富集分析有啥关系？....基因集合功能富集分析。那么我们就需要有一个基因集合（如差异表达基因集合或ChIP-seq的Peaks或GWAS定位的系列区间），还有一个功能标签（如 生长素信号转导相关 ）。于是黑白球案例可以简单调整一下。假定现在这个物种一共有100个基因，其中20个基因与生长素信号转导相关，80个没有注释到与生长素信号转导相关（换句话说，约等于无关），我们做了对植株做了处理，和CK分别测定转录表达谱，通过差异表达分析，鉴定到10个差异表达基因，其中2个与生长素信号转导相关，而另外8个则没注释到生长素信号转导相关，简单画一下，即
好，剩下的两个就不替换了。整体上，ORA模式的富集分析，本身就是经典的抽球案例，感兴趣的自行替换就可以了。
基本原理，相信都搞清楚了。不过还是有两三点需要注意：
具体如何做物种所有基因的背景注释，请参考前述推文《零基础快速完成基因功能注释 / GO / KEGG / PFAM...》。
首先，打开 TBtools GO 富集分析界面
整体如上，一共三个文件：
具体示例如下
点击 Start ，随后等待即可。完成时会有弹窗提示。查看输出文件
（写到这里，突然觉得这些都没啥意思，不知为何....就不详细写了，大伙自己看看列名，猜猜吧）
很多时候，我们会选择，筛选第一列，只看 Biological Process。一般这些与我们的生物学认知会贴近一些。
基因集合功能富集分析，是一个常常被谈起的话题，甚至近期都有不少新方法或算法被提出。感兴趣的朋友可以去了解。这份教程，只与大伙说最简单，但也是使用最为广泛的一种富集分析模式。无论是不是 TBtools 用户，理论上来说，都可以轻松理解并掌握，从原理到实践。
写到一半，其实我已经不想写了。原因非常简单，这也是为什么在我之前，并没有一个人写出来 TBtools 类似的工具。不是写不了，而是不想写。有时候，随着能力增长和知识积累，往往不再愿意做一些简单的事情。或许这还涉及到年龄的增长，角色的转变，责任的变化....云云。
小时候，我以为写 TBtools 玩玩；
后来，我以为我会一直写下去；
现在，，，，，，
生物富集在生物信息中有着重要的地位，做生物信息分析的时候总会遇到这样或者那样的富集分析，比如GO富集分析等。大多数情况下我们都是使用线上在线分析解决。是否会遇到这样一种情况，当我们不能使用在线分析的时候，如何对我们感兴趣的基因进行富集呢？
这似乎是一个很有趣的问题....
那我们今天就来追溯生物 富集 的前世今生....
比如我们现在遇到了这样一个问题：
从数据来看，我们鉴定的6个基因中有有4个在这个通路里，显然这个病毒和这个通路有着特殊的联系，但似乎又觉得有一些不太对的地方。
显然我们需要一个指标来证明我们鉴定的6个基因确实通过特殊的富集才得到的...
我们将上面的问题简化为一个数学问题来看的话，这似乎就是一个摸球问题：
那怎么计算这个概率呢？通过排列组合和概率论的知识可以得到
也就是说我们随机抽取一次，其中抽到4个黑球的概率是0.196
那我们将这个公式继续推广可以得到：
这似乎就是一个超几何分布模型
假设有限总体包含N个球，其中黑球为M个，则剩余的N-M个为白球，如果从该有限总体中抽取出n个球，其中有k个是黑球的概率。
回到我们的问题，从6个球中抽到了4个黑球这个事件到底是否具有显著性呢？
我们在前面计算出了抽到4个黑球的概率是0.196 这个值是不能拿来直接用的，必须要对其进行一个评估，因为我们必须要考虑到随机情况
在这里我们就用到了超几何分布检验（ Hyper Geometric Test）
怎么理解超几何分布检验呢？
我们给一个假设，此次抽样与随机抽样没有差异（原假设）
P值就是当 原假设为真时所得到的样本观察结果或更极端结果出现的概率 。如果P值很小，说明这种情况的发生的概率很小，而如果出现了，根据小概率原理，我们就有理由拒绝原假设。
当前的样本观测结果是黑色的球为4个，更极端的结果就是k=5,k=6的情况
因此我们得到如下计算结果：
从而得到的p值结果为0.230769 因此我们按照95%的置信区间来看，0.230769>0.05
因此我们不认为这是一个小概率事件，因此我们认为此次抽球与随机抽取没有差别
回到我们最初的生物学问题，如果我们发现有 5 个基因在特殊通路中的话，那么
p=p(x=5)+p(x=6)=0.034965 <0.05
此时我们就拒绝原假设，认为这是一个小概率事件，也就是我们鉴定的基因和通路有比较强的联系。
如何对p值进行计算呢？
R语言
其中4 为抽取6个球中黑球的数目 ，7 为袋子黑球的数目，8为袋中白球的数目，6为所抽球的个数
python
其中4 为抽取6个球中黑球的数目,15为袋中黑白球总数，7 为袋子黑球的数目，6为所抽球的个数
解决了p值后还会遇到另一个问题就是，在我们对鉴定到的差异差异基因做通路富集后，通常会计算一个p值。当某个通路的p值小于0.05（5%）时，我们通常认为这个通路是通过富集得到的。但是仍旧有5%的概率就是这个通路是通过随机抽取得到的。那么我们就错误地否认了原假设，导致了假阳性的产生（犯错的概率为5%）。
如果检验一次，犯错的概率是5%；检测10000次，犯错的次数就是500次，即额外多出了500次差异的结论（即使实际没有差异）。
为了控制假阳性的次数，于是我们需要对p值进行多重检验校正，提高阈值。
具体细节可以移步 浅谈多重检验校正FDR
