常用的质量控制的指标： 平均数法、RLE、NUSE和RNA降解曲线 根据以上指标综合决定实验是否合格，并提出质量不合格的样品。
可以看出，这个芯片的整体检查率并不太高，且GSE23740、GSM23745、GSM23746、GSM23750、GSM2375和GSM23757的RLE和NUSE偏离中心太多，整体RNA降解斜率偏低。在实际科研中，我们最好寻找高质量的芯片。
考虑到整体芯片质量不佳，过滤后剩余的样本数会比较少，下面就假装质量还可以进行下游分析（请大家谅解！）
当然affy包主要针对的是旧版的Affymetrix芯片，如hgu95/95和hgu133系列。下一篇我们来看看oligo包。
参考链接：
R语言_Affymetrix芯片数据处理
用affy包读取affymetix的基因表达芯片数据-CEL格式数据
使用oligo dT引物扩增的产物, 可以保证扩增产物包括mRNA的3'末端(减少rRNA的干扰), 但是oligo dT primer扩增有一个问题, 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的问题, 之所以有长度这个问题,一方面和lz所提到的RNA完整性有关,但最重要的限制在于逆转录酶的延伸能力. 用oligo dT primer扩增可能出现扩增出来的片段长度短, 虽然都有mRNA的3'端, 但是序列信息多位于3'-UTR附近, 若扩增序列太短,则有用信息很少, 不利于序列的识别和分析.使用random primer, 也有片段长度的限制, 但是由于它的逆转录并不一定在mRNA的末端起始, 而是在随机位置起始,所以它的扩增片段带有更多CDS的信息.但是如果是用总RNA逆转录的话,有可能会受到rRNA的干扰.
至于Gsp,只是在扩增已知gene/gene family以及部分原理的RACE中使用.
如果接下来你的PCR产物是外显子，就用oligo dT
如果是内含子或者包括部分内含子，就用random；
1 随机6具体引物：当特定M RNA含有使反转录酶终止的序列而难合成全长时可采用随机6具体引物来拷贝M RNA。用此引物合成的C DNA96%源与R RNA
2 oligo dt ：是一种对M RNA 特异的方法，因决大多数真核生物M RNA都有 POLY A结构，故仅M RNA被转录。做RT一般都用他做引物，特异性较强。
3 特异性引物：用含目标RNA的互补序列寡核甘酸做引物，可导致更为特异的扩增长物。
【求助】如何验证引物特异性？？
我做的PCR结果除了目的条带还稳定地出现一条同样大小的非目的条带，我想应该是引物的问题，但是怎么验证引物扩增的就只有靶基因的目的条带还是有其他匹配的可扩增的非目的条带啊？
急切盼望各位高手指点！！
OLIGE。6软件就可以验证引物的特异性。。如果存在同源性你可以BLAST一下。我不知道你的非目的条带是指什么？如果在100BP一下的应该是引物二聚体。。做普通PCR影响不大。。荧光定量的就不能有任何非目的条带。。我建议你提高一下退火温度。。每次提高3-4度随着温度的升高目的基因的特异性就越高杂带就越少。。但是目的基因扩增出来的量就会变少。。如果提高温度不行那就要换换引物。。不要轻易更换引物。要反复的做预试验。。
非常感谢啊！
我说的非特异条带不是引物二聚体，退火温度也提高试过了，还是有。
但是olige.6和blast我还不怎么会用啊，能否有具体的操作方法啊？
谢谢了啊！
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo 6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。oligo的下载和安装我就不多说了，打开oligo相信也无需多讲。
单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口
在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开
选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”
出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”
出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显示更清楚了。
∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。再点击Search再点“Fo'r Primers and probes”或使用快捷键F3
