>islands
里面根本没有你的变量Sepal.Length和Islands，怎么画图。
你可以看看手册上的范例:
boxplot(count ~ spray, data = InsectSprays, col = "lightgray")
打开数据库 InsectSprays
>InsectSprays
可以看到列名就是count和spray，就是以spray为level，画count的箱线图
“参考网址1”中提到如果只是对整数运算（运算过程和结果都只使用整数），没有必要使用“double”(8 byte)，而应该用更小的“integer”(4 byte)。使用storage.mode(x)查看对象存数的模式，storage.mode(x) <- 进行赋值；使用format(object.size(a), units = 'auto')查看对象占用的内存空间（此处有疑问，即在R中每个integer到底占用了多大的空间？）。需要解释gc()函数，可以查看内存使用情况。同样，在清除了大的对象之后，使用gc()以释放内存使用空间。
李航在”参考网址2“中提到，对于大矩阵的操作，尽量避免使用cbind和rbind之类，因为这会让内存不停地分配空间。“对于长度增加的矩阵，尽量先定义一个大矩阵，然后逐步增加”和“注意清除中间对象”。
使用bigmemory家族：bigmemory, biganalytics, synchronicity, bigtabulate and bigalgebra， 同时还有
biglm。
bigmemory package的使用：
1. 建立big.memory对象
bigmemory采用C++的数据格式来“模仿”R中的matrix。
编写大数据格式文件时候，可以先建立filebacked.big.matrix
big.matrix(nrow, ncol, type = options()$bigmemory.default.type, init = NULL, dimnames = NULL, separated = FALSE, backingfile = NULL, backingpath = NULL, descriptorfile = NULL, shared = TRUE)
filebacked.big.matrix(nrow, ncol, type = options()$bigmemory.default.type, init = NULL, dimnames = NULL, separated = FALSE, backingfile = NULL, backingpath = NULL, descriptorfile = NULL)
as.big.matrix(x, type = NULL, separated = FALSE, backingfile = NULL, backingpath = NULL, descriptorfile = NULL, shared=TRUE)
使用注意：
big.matrix采用两种方式储存数据：一种是big.matrix默认的方式，如果内存空间比较大，可以尝试使用；另外一种是filebacked.big.matrix，这种储存方法可能会备份文件（file-backings），而且需要descriptor file；
“init”指矩阵的初始化数值，如果设定，会事先将设定的数值填充到矩阵中；如果不设置，将处理为NA
"type"是指在big.matrix中atomic element的储存格式，默认是“double”(8 byte)，可以改为“integer”(4 byte), "short"(2 byte) or "char"(1 byte)。注意：这个包不支持字符串的储存，type = "char"是指ASCII码字母。
在big.matrix非常大的时候，避免使用rownames和colnames(并且bigmemory禁止用名称访问元素)，因为这种做法非常占用内存。如果一定要改变，使用options(bigmemory.allow.dimnames=TRUE)，之后colnames, rownames设置。
直接在命令提示符后输入x（x是一个big matrix），将返回x的描述，不会出现所有x中所有内容。因此，注意x[ , ](打印出矩阵全部内容)；
如果big.matrix有很多列，那么应该将其转置后储存；（不推荐）或者将参数“separated”设置为TRUE，这样就将每一列分开储存。否则，将用R的传统方式（column major的方式）储存数据。
如果建立一个filebacked.big.matrix，那么需要指定backingfile的名称和路径+descriptorfile。可能多个big.matrix对象对应唯一一个descriptorfile，即如果descriptorfile改变，所以对应的big.matrix随之改变；同样，decriptorfile随着big.matrix的改变而改变；如果想维持一种改变，需要重新建立一个filebacked.big.matrix。attach.big.matrix(descriptorfile or describe(big.matrix))函数用于将一个descriptorfile赋值给一个big.matrix。这个函数很好用，因为每次在创建一个filebacked.big.matrix后，保存R并退出后，先前创建的矩阵会消失，需要再attach.big.matrix以下
2. 对big.matrix的列的特定元素进行条件筛选
对内存没有限制；而且比传统的which更加灵活（赞！）
mwhich(x, cols, vals, comps, op = 'AND')
x既可以是big.matrix，也可以是传统的R对象；
cols：行数
vals：cutoff，可以设定两个比如c(1, 2)
comps：'eq'(==), 'neq'(!=), 'le'(<), 'lt'(<=), 'ge'(>) and 'gt'(>=)
op：“AND”或者是“OR”
可以直接比较NA，Inf和-Inf
3.bigmemory中其他函数
nrow, ncol, dim, dimnames, tail, head, typeof继承base包
big.matrix, is.big.matrix, as.big.matrix, attach.big.matrix, describe, read.big.matrix, write.big.matrix, sub.big.matrix, is.sub.big.matrix为特有的big.matrix文件操作；filebacked.big.matrix, is.filebacked（判断big.matrix是否硬盘备份） , flush(将filebacked的文件刷新到硬盘备份上)是filebacked的big.matrix的操作。
mwhich增强base包中的which， morder增强order，mpermute（对matrix中的一列按照特定序列操作，但是会改变原来对象，这是为了避免内存溢出）
big.matrix对象的copy使用deepcopy(x, cols = NULL, rows = NULL, y = NULL, type = NULL, separated = NULL, backingfile = NULL, backingpath = NULL, descriptorfile = NULL, shared=TRUE)
biganalytics package的使用
biganalytics主要是一些base基本函数的扩展，主要有max, min, prod, sum, range, colmin, colmax, colsum, colprod, colmean, colsd, colvar, summary, apply（只能用于行或者列，不能用行列同时用）等
比较有特色的是bigkmeans的聚类
剩下的biglm.big.matrix和bigglm.big.matrix可以参考Lumley's biglm package。
bigtabulate package的使用
并行计算限制的突破：
使用doMC家族：doMC, doSNOW, doMPI, doRedis, doSMP和foreach packages.
foreach package的使用
foreach(..., .combine, .init, .final=NULL, .inorder=TRUE, .multicombine=FALSE, .maxcombine=if (.multicombine) 100 else 2, .errorhandling=c('stop', 'remove', 'pass'), .packages=NULL, .export=NULL, .noexport=NULL, .verbose=FALSE)
foreach的特点是可以进行并行运算，如在NetWorkSpace和snow？
%do%严格按照顺序执行任务（所以，也就非并行计算），%dopar%并行执行任务
...：指定循环的次数；
.combine：运算之后结果的显示方式，default是list，“c”返回vector， cbind和rbind返回矩阵，"+"和"*"可以返回rbind之后的“+”或者“*”
.init：.combine函数的第一个变量
.final：返回最后结果
.inorder：TRUE则返回和原始输入相同顺序的结果（对结果的顺序要求严格的时候），FALSE返回没有顺序的结果（可以提高运算效率）。这个参数适合于设定对结果顺序没有需求的情况。
.muticombine：设定.combine函数的传递参数，default是FALSE表示其参数是2，TRUE可以设定多个参数
.maxcombine：设定.combine的最大参数
.errorhandling：如果循环中出现错误，对错误的处理方法
.packages：指定在%dopar%运算过程中依赖的package（%do%会忽略这个选项）。
getDoParWorkers( ) ：查看注册了多少个核，配合doMC package中的registerDoMC( )使用
getDoParRegistered( ) ：查看doPar是否注册；如果没有注册返回FALSE
getDoParName( ) ：查看已经注册的doPar的名字
getDoParVersion( )：查看已经注册的doPar的version
===================================================
# foreach的循环次数可以指定多个变量，但是只用其中最少？的
>foreach(a = 1:10, b = rep(10, 3)) %do% (a*b)
[[1]]
[1] 10
[[2]]
[1] 20
[[3]]
[1] 30
# foreach中.combine的“+”或者“*”是cbind之后的操作；这也就是说"expression"返回一个向量，会对向量+或者*
>foreach(i = 1:4, .combine = "+") %do% 2
[1] 8
>foreach(i = 1:4, .combine = "rbind") %do% rep(2, 5)
[,1] [,2] [,3] [,4] [,5]
result.122222
result.222222
result.322222
result.422222
>foreach(i = 1:4, .combine = "+") %do% rep(2, 5)
[1] 8 8 8 8 8
>foreach(i = 1:4, .combine = "*") %do% rep(2, 5)
[1] 16 16 16 16 16
=============================================
iterators package的使用
iterators是为了给foreach提供循环变量，每次定义一个iterator，它都内定了“循环次数”和“每次循环返回的值”，因此非常适合结合foreach的使用。
iter(obj, ...)：可以接受iter, vector, matrix, data.frame, function。
nextElem(obj, ...)：接受iter对象，显示对象数值。
以matrix为例，
iter(obj, by=c('column', 'cell', 'row'), chunksize=1L, checkFunc=function(...) TRUE, recycle=FALSE, ...)
by：按照什么顺序循环；matrix和data.frame都默认是“row”，“cell”是按列依次输出（所以对于“cell”，chunksize只能指定为默认值，即1）
chunksize：每次执行函数nextElem后，按照by的设定返回结果的长度。如果返回结构不够，将取剩余的全部。
checkFunc=function(...) TRUE：执行函数checkFun，如果返回TRUE，则返回；否则，跳过。
recycle：设定在nextElem循环到底（“错误: StopIteration”）是否要循环处理，即从头再来一遍。
以function为例
iter(function()rnorm(1))，使用nextElem可以无限重复；但是iter(rnorm(1))，只能来一下。
更有意思的是对象如果是iter，即test1 <- iter(obj)test2 <- iter(test1)，那么这两个对象是连在一起的，同时变化。
==============================================
>a
[,1] [,2] [,3] [,4] [,5]
[1,]159 13 17
[2,]26 10 14 18
[3,]37 11 15 19
[4,]48 12 16 20
>i2 <- iter(a, by = "row", chunksize=3)
>nextElem(i2)
[,1] [,2] [,3] [,4] [,5]
[1,]159 13 17
[2,]26 10 14 18
[3,]37 11 15 19
>nextElem(i2) #第二次iterate之后，只剩下1行，全部返回
[,1] [,2] [,3] [,4] [,5]
[1,]48 12 16 20
>i2 <- iter(a, by = "column", checkFunc=function(x) sum(x) >50)
>nextElem(i2)
[,1]
[1,] 13
[2,] 14
[3,] 15
[4,] 16
>nextElem(i2)
[,1]
[1,] 17
[2,] 18
[3,] 19
[4,] 20
>nextElem(i2)
错误: StopIteration
>colSums(a)
[1] 10 26 42 58 74
>testFun <- function(x){return(x+2)}
>i2 <- iter(function()testFun(1))
>nextElem(i2)
[1] 3
>nextElem(i2)
[1] 3
>nextElem(i2)
[1] 3
>i2 <- iter(testFun(1))
>nextElem(i2)
[1] 3
>nextElem(i2)
错误: StopIteration
>i2 <- iter(testFun(1))
>i3 <- iter(i2)
>nextElem(i3)
[1] 3
>nextElem(i2)
错误: StopIteration
============================================
iterators package中包括
irnorm(..., count)；irunif(..., count)；irbinom(..., count)；irnbinom(..., count)；irpois(..., count)中内部生成iterator的工具，分别表示从normal，uniform，binomial，negativity binomial和Poisson分布中随机选取N个元素，进行count次。其中，negative binomial分布：其概率积累函数(probability mass function)为掷骰子，每次骰子为3点的概率为p，在第r+k次恰好出现r次的概率。
icount(count)可以生成1:conunt的iterator；如果count不指定，将从无休止生成1:Inf
icountn(vn)比较好玩，vn是指一个数值向量（如果是小数，则向后一个数取整，比如2.3 -->3）。循环次数为prod(vn)，每次返回的向量中每个元素都从1开始，不超过设定 vn，变化速率从左向右依次递增。
idiv(n, ..., chunks, chunkSize)返回截取从1:n的片段长度，“chunks”和“chunkSize”不能同时指定，“chunks”为分多少片段（长度从大到小），“chunkSize”为分段的最大长度（长度由大到小）
iapply(X, MARGIN)：与apply很像，MARGIN中1是row，2是column
isplit(x, f, drop=FALSE, ...)：按照指定的f划分矩阵
=============================================
>i2 <- icountn(c(3.4, 1.2))
>nextElem(i2)
[1] 1 1
>nextElem(i2)
[1] 2 1
>nextElem(i2)
[1] 3 1
>nextElem(i2)
[1] 4 1
>nextElem(i2)
[1] 1 2
>nextElem(i2)
[1] 2 2
>nextElem(i2)
[1] 3 2
>nextElem(i2)
[1] 4 2
>nextElem(i2)
错误: StopIteration
下游分析
cellranger count 计算的结果只能作为错略观测的结果，如果需要进一步分析聚类细胞，还需要进行下游分析，这里使用官方推荐 R 包（Seurat 3.0）
流程参考官方外周血分析标准流程（ https://satijalab.org/seurat/v3.0/pbmc3k_tutorial.html ）
Rstudio操作过程：
## 安装seurat
install.packages('Seurat')
## 载入seurat包
library(dplyr)
library(Seurat)
## 读入pbmc数据（文件夹路径不能包含中文，注意“/“的方向不能错误，这里读取的是10x处理的文件，也可以处理其它矩阵文件，具体怎样操作现在还不知道，文件夹中的3个文件分别是：barcodes.tsv，genes.tsv，matrix.mtx，文件的名字不能错，否则读取不到）
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "D:/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
## 查看稀疏矩阵的维度,即基因数和细胞数
dim(pbmc.data)
pbmc.data[1:10,1:6]
## 创建Seurat对象与数据过滤，除去一些质量差的细胞（这里读取的是单细胞 count 结果中的矩阵目录；在对象生成的过程中，做了初步的过滤；留下所有在>=3 个细胞中表达的基因 min.cells = 3；留下所有检测到>=200 个基因的细胞 min.genes = 200。)
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
pbmc
##计算每个细胞的线粒体基因转录本数的百分比（%）,使用[[ ]] 操作符存放到metadata中，mit-开头的为线粒体基因
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
##展示基因及线粒体百分比（这里将其进行标记并统计其分布频率，"nFeature_RNA"为基因数，"nCount_RNA"为细胞数，"percent.mt"为线粒体占比）
VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
## 过滤细胞：根据上面小提琴图中基因数"nFeature_RNA"和线粒体数"percent.mt"，分别设置过滤参数，这里基因数 200-2500，线粒体百分比为小于 5%，保留gene数大于200小于2500的细胞；目的是去掉空GEMs和1个GEMs包含2个以上细胞的数据；而保留线粒体基因的转录本数低于5%的细胞,为了过滤掉死细胞等低质量的细胞数据。
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA >200 &nFeature_RNA <2500 &percent.mt <5)
## 表达量数据标准化,LogNormalize的算法：A = log( 1 + ( UMIA ÷ UMITotal ) × 10000
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
#pbmc <- NormalizeData(pbmc) 或者用默认的
## 鉴定表达高变基因(2000个）,用于下游分析,如PCA；
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
## 提取表达量变化最高的10个基因；
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
top10
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10)
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))
plot1<-VariableFeaturePlot(object=pbmc)
plot2<-LabelPoints(plot=plot1,points=top10,repel=TRUE)
CombinePlots(plots=list(plot1,plot2))
## PCA分析：
# PCA分析数据准备,使用ScaleData()进行数据归一化；默认只是标准化高变基因（2000个）,速度更快,不影响PCA和分群,但影响热图的绘制。
#pbmc <- ScaleData(pbmc,vars.to.regress ="percent.mt")
## 而对所有基因进行标准化的方法如下：
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)
pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")
## 线性降维（PCA）,默认用高变基因集,但也可通过features参数自己指定；
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))
## 展示 pca 结果（最简单的方法）
DimPlot(object=pbmc,reduction="pca")
## 检查PCA分群结果, 这里只展示前5个PC,每个PC只显示5个基因；
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)
##PC_ 1
##Positive: RPS27, MALAT1, RPS6, RPS12, RPL13
##Negative: CSTA, FCN1, CST3, LYZ, LGALS2
##PC_ 2
##Positive: NKG7, GZMA, CST7, KLRD1, CCL5
##Negative: RPL34, RPL32, RPL13, RPL39, LTB
##PC_ 3
##Positive: MS4A1, CD79A, BANK1, IGHD, CD79B
##Negative: IL7R, RPL34, S100A12, VCAN, AIF1
##PC_ 4
##Positive: RPS18, RPL39, RPS27, MALAT1, RPS8
##Negative: PPBP, PF4, GNG11, SDPR, TUBB1
##PC_ 5
##Positive: PLD4, FCER1A, LILRA4, SERPINF1, LRRC26
##Negative: MS4A1, CD79A, LINC00926, IGHD, FCER2
## 展示主成分基因分值
VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")
## 绘制pca散点图
DimPlot(pbmc, reduction = "pca")
## 画第1个或15个主成分的热图；
DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)
DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)
## 确定数据集的分群个数
# 鉴定数据集的可用维度，方法1：Jackstraw置换检验算法；重复取样（原数据的1%）,重跑PCA,鉴定p-value较小的PC；计算‘null distribution’(即零假设成立时)时的基因scores。虚线以上的为可用维度，也可以调整 dims 参数，画出所有 pca 查看。
#pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
#pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
#JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)
# 方法2：肘部图（碎石图）,基于每个主成分对方差解释率的排名。
ElbowPlot(pbmc)
## 细胞聚类：分群个数这里选择10,建议尝试选择多个主成分个数做下游分析,对整体影响不大；在选择此参数时,建议选择偏高的数字（为了获取更多的稀有分群,“宁滥勿缺”）；有些亚群很罕见,如果没有先验知识,很难将这种大小的数据集与背景噪声区分开来。
## 非线性降维（UMAP/tSNE)基于PCA空间中的欧氏距离计算nearest neighbor graph,优化任意两个细胞间的距离权重（输入上一步得到的PC维数） 。
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
## 接着优化模型,resolution参数决定下游聚类分析得到的分群数,对于3K左右的细胞,设为0.4-1.2 能得到较好的结果(官方说明)；如果数据量增大,该参数也应该适当增大。
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
## 使用Idents（）函数可查看不同细胞的分群；
head(Idents(pbmc), 5)
## 结果：AAACCTGAGGTGCTAG AAACCTGCAGGTCCAC AAACCTGCATGGAATA AAACCTGCATGGTAGG AAACCTGCATTGGCGC
1 3 0 10 2
Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
## Seurat提供了几种非线性降维的方法进行数据可视化（在低维空间把相似的细胞聚在一起）,比如UMAP和t-SNE,运行UMAP需要先安装'umap-learn'包，这里不做介绍，两种方法都可以使用，但不要混用，如果混用，后面的结算结果会将先前的聚类覆盖掉，只能保留一个。
## 这里采用基于TSNE的聚类方法。
pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10)
## 用DimPlot()函数绘制散点图,reduction = "tsne",指定绘制类型；如果不指定,默认先从搜索 umap,然后 tsne, 再然后 pca；也可以直接使用这3个函数PCAPlot()、TSNEPlot()、UMAPPlot()； cols,pt.size分别调整分组颜色和点的大小；
DimPlot(pbmc,reduction = "tsne",label = TRUE,pt.size = 1.5)
## 这里采用基于图论的聚类方法
pbmc<-RunUMAP(object=pbmc,dims=1:10)
DimPlot(object=pbmc,reduction="umap")
## 细胞周期归类
pbmc<- CellCycleScoring(object = pbmc, g2m.features = cc.genes$g2m.genes, s.features = cc.genes$s.genes)
head(x = [email protected])
DimPlot(pbmc,reduction = "tsne",label = TRUE,group.by="Phase",pt.size = 1.5)
## 存储结果
saveRDS(pbmc, file = "D:/pbmc_tutorial.rds")
save(pbmc,file="D:/res0.5.Robj")
## 寻找cluster 1的marker
cluster1.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 1, min.pct = 0.25)
head(cluster1.markers, n = 5)
## 结果: p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj
MT-CO1 0.000000e+00 -0.6977083 0.985 0.996 0.000000e+00
RPS27 2.182766e-282 0.3076454 1.000 0.999 3.480202e-278
MT-CO3 2.146399e-274 -0.4866429 0.995 0.997 3.422218e-270
DUSP1 2.080878e-247 -1.7621662 0.376 0.745 3.317752e-243
RPL34 8.647733e-244 0.3367755 1.000 0.997 1.378795e-239
##寻找每一cluster的marker
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_logFC)
# A tibble: 24 x 7
# Groups: cluster [12]
p_val avg_logFC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene
<dbl> <dbl><dbl><dbl> <dbl><fct> <chr>
1 2.29e-123 0.636 0.344 0.097 3.65e-119 0 CD8B
2 7.62e-113 0.487 0.632 0.305 1.22e-108 0 LEF1
3 2.04e- 74 0.483 0.562 0.328 3.25e- 70 1 LEF1
4 1.39e- 61 0.462 0.598 0.39 2.22e- 57 1 ITM2A
5 0. 2.69 0.972 0.483 0. 2 GNLY
6 0. 2.40 0.964 0.164 0. 2 GZMB
7 1.31e-121 0.768 0.913 0.671 2.09e-117 3 JUNB
8 2.06e- 94 0.946 0.426 0.155 3.28e- 90 3 RGS1
9 2.05e-255 1.57 0.586 0.09 3.27e-251 4 GZMK
10 2.94e-140 1.57 0.69 0.253 4.68e-136 4 KLRB1
# ... with 14 more rows
## 存储marker
write.table(pbmc.markers,file="D:/allmarker.txt")
## 各种绘图
## 绘制Marker 基因的tsne图
FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", "CD8A"),cols = c("gray", "red"))
## 绘制Marker 基因的小提琴图
VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)
## 绘制分cluster的热图
top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
剩下的便是寻找基因 marker 并对细胞类型进行注释(见下回分解)
