实验记录3：用R包Seurat进行QC、PCA分析与t-SNE聚类

2023-02-24 15:00:02Python025

实验记录3：用R包Seurat进行QC、PCA分析与t-SNE聚类,第1张

参考网站： https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html

（注意！！！现在这个网站会自动跳转到3.0版本）

Seurat的安装：R中运行install.packages("Seurat")

经过Cellranger的数据整理之后，得到：

Seurat是一种R包，设计用于QC，分析和探索单细胞RNA-seq数据。 Seurat旨在使用户能够从单细胞转录组测量中识别和解释异质性来源，并整合不同类型的单细胞数据。

运行R，并且加载这两个包

读取数据

原始数据的 基因数为33694，细胞数为1960.

比较普通与疏松矩阵的内存使用：

初始化Seurat对象：

命令 CreateSeuratObject

输入数据spleen.data

留下所有在>=3个细胞中表达的基因min.cells = 3；

留下所有检测到>=200个基因的细胞min.genes = 200。

(为了除去一些质量差的细胞)

剩下15655 基因和 1959 个细胞

以下步骤包括Seurat中scRNA-seq数据的标准预处理工作流程。这些代表了Seurat对象的创建，基于QC指标的细胞选择和过滤，数据标准化和缩放，以及高度可变基因的检测。

过滤细胞，根据上面的两幅图，去除异常值，这里选择基因数从300-5000，线粒体基因占比大于0.1的细胞。（主要看小提琴图1和图3）

查看过滤掉剩下多少细胞：

剩下15655个基因，1940个细胞。

加个log：

您的单细胞数据集可能包含“不感兴趣”的变异来源。这不仅包括 技术噪音 ，还包括 批次效应 ，甚至包括生物变异来源（细胞周期阶段）。正如(Buettner, et al NBT，2015)中所建议的那样，从分析中回归这些信号可以改善下游维数减少和聚类。为了减轻这些信号的影响，Seurat构建线性模型以基于用户定义的变量预测基因表达。这些模型的缩放得分残差存储在Scale.data槽中，用于降维和聚类。

我们可以消除由批次（如果适用）驱动的基因表达中的细胞 - 细胞变异，细胞比对率（由Drop-seq数据的Drop-seq工具提供），检测到的分子数量和线粒体基因表达。对于循环细胞，我们还可以学习“细胞周期”评分（参见此处的示例）并对其进行回归。在这个有丝分裂后血细胞的简单例子中，我们回归了每个细胞检测到的分子数量以及线粒体基因含量百分比。

主成分分析是什么？

将数据集降维，利用低阶的变量去反应整体的结果。

选择了前10个PC成分

将R变量保存，利于后续的分析。

一些补充：

过滤低质量细胞：

在 scRNA-seq 分析中，有些细胞质量比较低，比如细胞处于凋亡状态,细胞中 RNA 发生降解等,这些细胞的存在会影响分析，因此我们第一步需要对细胞进行过滤。主要可分为三类:

①利用细胞检测到的基因数或者是 reads 比对率来判断技术噪音。

但不管是基因检测数目还是比对率都跟实验方法有很大相关性。如果 比对率太低,表明 RNA 可能发生了降解,或者文库有污染或者细胞裂解不完全 。

②如果实验中加入了 spike-ins（本实验没有），可以通过计算比对到内源性 RNA 和外源性 RNA(spike-ins)的 reads 比例来过滤低质量细胞。

比值偏低表明细胞中的 RNA 数量较低，细胞可丢弃。但是也需要注意其实当细胞状态不一样，比如处于不同细胞周期时，细胞的 RNA 数量是具有很大差异的。不过我们依然认为在一大群细胞中，spike-ins比例特别高的细胞在很大概率上应该被排除在外。软件 SinQC (Single-cell RNA-seq Quality Control)可以根据比对率和检测到的基因数来过滤细胞。

③根据整体的基因表达谱来定义技术噪音。

比如对细胞进行聚类分析，PCA 分析等，将 outlier 细胞删除，或者细胞表达中位值低于某一设定阈值时将该细胞过滤掉。当然这种方法也存在误删具有真正生物学差异的细胞,因此在删除细胞时需要小心，可与上述另外两种方法连用。

如果你的数据量过大，使用Seurat时内存不足，请看

实验记录11：海量scRNA-seq数据的质量控制、PCA、聚类

在R中有 6中索引编写方式 ，包括 正整数、负整数、零、空格、逻辑值、名称

与正整数索引相反，它的含义是 不包含 负整数索引所对应的元素。

说实话，零索引并没有多大用处。这里就不介绍了

代表选取该索引位置所代表维度的所有元素。

当索引提供一个包含TRUE和FALSE逻辑值的向量时，R会匹配索引值为TRUE的元素。 此索引方式非常重要

编写一个可以返回第一行所有元素的函数

问题：这样每次发牌都是黑桃K，所以我们要在每次发完牌后进行洗牌，然后再发，现在写一个洗牌的函数

下面写一个输入进去deck输出一个洗牌后的数据框的函数

$ 可以提取数据框或列表对象中的值。

列表提取元素

掌握R语言的索引，最基本操作为 写出对象名字，并在随后中括号里写出对应的索引即可 。若对象是一维的，如向量，只需要提供一个位置索引；若对象是二维的，如数据框，则提供两个位置索引，中间用逗号隔开。n维则用n个索引。另外数据框和列表还可用 $ 来索引。

一、分析需求

1.对共享单车满意度评分数据进行清洗，去除空缺值等

2.对用户满意度分数的整体情况进行分析

3.对于收押金这一举措，用AB测试思路来检测收押金是否会影响用户满意度

二、数据情况（实验数据）

北京四个城区调研客户对共享单车的满意程度，并分为了对照组和实验组，分别对收押金前后的满意程度进行了统计

三、分析过程

1. 清洗数据填补空值

对数据进行整理清理，其中分数有些许空缺值，填补缺失值采用的统计量是去除空值后的分数的平均值，填补缺失值大小是5.458333，实现语句：

setwd("C:/Users/emera/Desktop/共享单车评分数据")

R_homework <-

read.csv("共享单车评分数据.csv",fileEncoding ="UTF-8-BOM")

#查看数据整体情况

str(R_homework)

#查看是否有空值

is.na(R_homework$城区)

is.na(R_homework$分数)

is.na(R_homework$组别)

is.na(R_homework$推荐者)

is.na(R_homework$年龄)

#填充空值

alternative_value<-

mean(R_homework$分数,na.rm = TRUE)

R_homework[is.na(R_homework$分数), "分数"] <-alternative_value

is.na(R_homework$分数)

2. 对分数整体显现情况进行初步分析

从直方图中可以看出，朝阳区和东城区给出8分的用户最多，西城区给出7分的用户最多。海淀区分数两级分化情况比较严重，给最多的分数是9分和3分，同时高分（分数7分以上）数量比其他区域高，但低分（3分以下）的数量也很高。

从箱型图中我们可以进一步看出，朝阳区、东城区、西城区用户的平均分相近，海淀区平均分最高，但是海淀区的分数也是最分散的。从小提琴图中，我们可以看到西城区高分面积最大，低分面积最小，海淀区呈现两极分化的葫芦形，东城区各分数段数量分布比较均匀，朝阳区数据离散度较小。

实现语句：

#直方图

library(ggplot2)

a <-

ggplot(R_homework,aes(分数))

a +geom_histogram(binwidth = 1)

facet_wrap(~城区,nrow=2,ncol=2)+

#箱型图

b <-

ggplot(R_homework,aes(城区,分数))

b + geom_boxplot()

#小提琴图

c <-

ggplot(R_homework,aes(城区,分数))

c +geom_violin(draw_quantiles = c(0.25,0.5,0.75))

3. 各个城区用户给分和年龄关系分析

我们对散点图进行线性拟合。从图中可以看出，各个区域的样本取样较为随机，不存在某一年龄段取样集中的不合理现象。对图形进行观察，发现拟合程度都近似，各个区域打分均表现出和年龄的正相关性。其中朝阳区和东城区的拟合情况最为集中，海淀区和西城区的拟合函数更为陡峭（斜率更高）。有趣的是，各个区域25-30岁的用户打分都在拟合函数之上，25岁以下和30岁以上大多在拟合函数之下。也就是说如果我们用拟合函数最各年龄段的满意度预估，25-30岁区间的满意度更有可能高于预估值，25岁以下和30岁以上区间的满意度更有可能低于预估值。

实现语句：

#散点图拟合年龄和分数关系

g <-

ggplot(R_homework,aes(年龄,分数))

g + geom_point(alpha =0.25)+

geom_smooth(method='lm',col='red')+

theme_bw(base_family= "Avenir",base_size = 15)+

facet_wrap(~城区,nrow=2,ncol=2)+

labs(x='年龄(age)')+

labs(y='分数(score)')+

labs(title='用户满意度调查（分数与年龄关系）')

4. 对“收押金”措施是否对西城区用户满意分有显著影响设计A/B测试